多能干细胞（ES/iPS）冻存和复苏方法

    多能干细胞(ES/iPS)冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环，但是多能干细胞不同于普通细胞系，其增殖扩增过程中需要聚团生长，为保持其细胞活性，不建议单细胞传代。而   且使用血清+DMSO 冻存方法，不能很好的保持细胞活性，且复苏细胞成活率较低。本文就重点介绍多能干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤。
    介绍使用 AppliedCell? 多能干细胞培养基以及 Advance 多能干细胞培养基培养的细胞， 本方法适用于 AppliedCell? 多能干细胞培养基以及 Advance 多能干细胞培养基培养的细（同样适用于 mTesR 以及 E8 系统培养的细胞），冻存以及复苏前后，应当使用同一种培养基，复苏传代后可以更换其他培养体系。
Serum-Free 干细胞冻存液（AC-1001011/12）是埃泽思生物专为 ES/iPS 细胞设计的的一款化学成分确定，无血清，无动物源成分，且*程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下：
1、冻存：以下操作方法以 6 孔板为例：
（1）Serum-Free 干细胞冻存液为即拿即用，且 4℃保存，冻存液拿出后应快速放回 4℃；
（2）使用多能干细胞消化液（AC-1001008）消化细胞；
（3）收集细胞，室温 300×g 离心 5 分钟；
（4）小心吸掉上清液，不要干扰细胞团；
（5）用 1mL 冻存液重悬细胞，并均匀分装到冻存管中
采用非程序降温法，将冻存管直接放入-80℃冰箱中，冻存 24h 后转移至中长期保
存。
2、解冻
预先包被细胞培养板，人 ES 和 iPS 细胞解冻后应立即接种到培养板中。
（1）多能干细胞培养基/Advance 多能干细胞培养基室温平衡 15-30min,不能 37℃加热;
（2）在水浴锅中持续晃动冻存管，37℃水浴锅中快速解冻细胞，直至细胞完全融化；
（3）取出冻存管，用 70％擦拭冻存管表面；
（4）准备 15mL 离心管，预先加入 5mL 多能干细胞培养基，将细胞悬浮液缓慢逐滴至
15mL 离心管中，尽量保持细胞聚团状态。
（5）在室温 300×g 离心 5 分钟。
（6）吸掉上清，注意不要干扰细胞沉淀。使用 1mL 多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞
3-5 次，不要破坏细胞聚团状态。
（7）分别取 0.5mL 细胞悬液，均匀接种到包被好的 6 孔板的 2 个孔中，并分别补充多能干细胞培养基至 2m。
（8）置于 37°C 细胞培养箱中。在前后左右呈十字形摇动培养板板 5 次，以均匀分散细胞。
（9）每天更换培养基，并显微镜下观察细胞状/NewsInfo.aspx?id=22